Introdução à PCR - Roche Portugal

Introdução à PCR

A Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica de Biologia Molecular que permite replicação in vitro do ADN de forma extremamente rápida. Com a PCR, quantidades mínimas de material genético podem ser amplificadas milhões de vezes em poucas horas, permitindo a detecção rápida e fiável dos marcadores genéticos de doenças infecciosas, cancro ou doenças genéticas.

O uso da tecnologia de Reacção em Cadeia da Polimerase aumentou enormemente a capacidade dos cientistas para estudar o material genético. Desde a sua invenção por cientistas da Cetus Corporation em 1983, a PCR mudou a forma como se realiza investigação e diagnóstico médico. A capacidade de produzir rapidamente grandes quantidades de material genético permitiu avanços científicos significativos em todas as áreas de investigação genómica. A tecnologia de PCR influenciou ainda significativamente as áreas de diagnóstico e seguimento de doentes, em particular nas áreas de HIV/SIDA e Hepatite C.

Desde o primeiro momento, os cientistas da Roche aperceberam-se da importância e do potencial da tecnologia de PCR. A Roche tem vindo a desenvolver esforços no sentido de aperfeiçoar os vários passos e componentes da reacção de replicação (por exemplo, enzimas polimerases termoestáveis). A Roche oferece preparações enzimáticas optimizadas e inovadoras, kits de qualidade e fiabilidade, que permitem a obtenção de óptimos resultados.

 

Quais são os passos da PCR?

A PCR está desenhada de acordo com o princípio natural de replicação de ADN. Este é um processo que decorre em três passos, que em conjunto se designam como um ciclo e que se repete um número específico de vezes.

Assim, um ciclo de PCR consiste nos seguintes passos:

     1. Desnaturação
     2. Hibridização ou Annealing
     3. Extensão

Este processo tem lugar num termociclador, um equipamento que automaticamente controla e alterna as temperaturas durante períodos programados de tempo para o número apropriado de ciclos de PCR (geralmente entre 30 e 40 ciclos).

 

1º Passo – Desnaturação térmica

A temperatura elevada (geralmente >90ºC) separa a cadeia dupla de ADN em dois filamentos, sendo este processo conhecido como “desnaturação”.
Os dois filamentos ou cadeias de ADN são mantidos juntos por ligações de hidrogénio que, por serem relativamente fracas, quebram-se a altas temperaturas, ao passo que as ligações entre as moléculas de fosfato e desoxirribose, por serem ligações covalentes mais fortes, permanecem intactas.

 

 

2º Passo – Hibridização ou Annealing

O objectivo da PCR não é replicar a cadeia inteira de ADN, mas apenas replicar a sequência de interesse (normalmente com tamanhos entre 100 e 600 pares de bases) que é única no organismo. 
Os iniciadores (ou primers) marcam as extremidades da sequência alvo: estes iniciadores são curtas sequências sintéticas de nucleótidos, entre 20 e 30 bases. 
Numa reacção de PCR são incluídos dois primers, um para cada cadeia simples de ADN que foi produzida durante o passo de desnaturação. O início da sequência de ADN alvo é marcada pelos primers que se ligam (hibridizam) com a sequência  complementar. 
Temperatura de annealing ou hibridização: normalmente encontra-se entre 40 ºC e 65 ºC, dependendo do comprimento dos primers e da sua sequência. A escolha criteriosa desta temperatura permite que estas sequências iniciadores se liguem à sequência alvo com elevada especificidade.

 

3º Passo: Extensão

Após a ligação dos primers ou iniciadores às sequências complementares de ADN, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72 ºC e a enzima Taq polimerase replica a cadeia de ADN. 
A Taq polimerase é uma polimerase de ADN termo-estável recombinante do organismo Thermus aquaticus, que, ao contrário de outras polimerases, se mantém activa a temperaturas elevadas. O processo de síntese é iniciado numa zona com cadeia dupla (onde estão ligados os primers), incorporando os nucleótidos complementares à sequência alvo e utilizando os dNTPs em solução. 
A extensão inicia-se sempre no extremo 3’ do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples. A Taq polimerase sintetiza exclusivamente na direcção 5’ para 3’.

 

Final do primeiro ciclo de PCR

No final do primeiro ciclo da PCR, encontramos duas novas cadeias de ADN idênticas à original. 
Ponto final: A ADN polimerase não reconhece o final da sequência. Assim, as novas cadeias sintetizadas têm o seu início definido pelo primer, mas a sua extremidade 3’ não está definida, podendo haver fragmentos de diferentes tamanhos. 
No entanto, no ciclo seguinte, esta cadeia vai servir de molde à síntese de uma nova cadeia, limitando o primer a outra extremidade da cadeia. 
A cadeia de ADN, sintetizada a partir deste molde, terá então o comprimento definido, com os limites definidos pelos primers. Estas cadeias denominam-se Amplicons. 
Após alguns ciclos, as cadeias de ADN, que correspondem ao tamanho exacto da sequência alvo, estão presentes num número muito maior do que as sequências de comprimento variável. 
Por outras palavras, a sequência flanqueada pelos iniciadores ou primers é a secção do ADN que se amplifica.

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